肠道固有层免疫细胞分离制备指南 - 尊龙凯时专注生物医疗创新

### 1. 实验前准备

#### 试剂准备

**40% Percoll溶液配制**：将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，制备等渗的100% Percoll母液。随后，将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS按体积比4:6混合，制备40%等渗的Percoll溶液。

**80% Percoll溶液**：同样将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，制备等渗的100% Percoll母液。然后用100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS按体积比8:2混合，得到80%等渗的Percoll溶液。

### 2. 肠道固有层免疫细胞分离步骤

1）使用颈椎脱臼法处死小鼠，固定在手术台上，用75%酒精消毒小鼠腹部并进行纵向切开以暴露腹腔；

2）在小鼠胃与十二指肠连接处剪断，边分离小肠周围脂肪组织和肠系膜，边轻轻拉出小肠，然后在小肠与盲肠连接处剪断，成功分离出小肠。

3）在10cm培养皿中加入5mL预冷至4°C的PBS，将小肠置入其中进行清洗，使用镊子和剪刀逐步去除脂肪组织和派伊尔结。值得注意的是，小鼠派伊尔结是肠道黏膜免疫系统的重要组成部分，去除派伊尔结有助于获取更纯净、具有代表性的细胞群体，从而提高实验结果的可靠性。

4）将小肠切割为4段，并纵向剪开以暴露肠内容物，轻轻刮除粘膜表面的肠内容物；

5）将小肠转移至含有10mL HBSS+2% FBS的50mL离心管中，剧烈涡旋10-20秒；

6）使用镊子取出小肠，并重复清洗两次；

7）将清洗后的肠组织剪碎成约0.5cm的小片段，移至2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液（abs50093)，于37°C的摇床上轻轻摇晃孵育60分钟（根据组织状况适当延长孵育时间）；

8）从摇床取出圆底管，剧烈涡旋10-20秒，通过70μm细胞筛网（abs7232）过滤，用10mL PBS冲洗细胞筛网；

9）将收集的细胞悬液转入50mL管中，20°C下以400g离心5分钟，弃去上清液，使用4mL 40% Percoll（abs9102）重悬细胞沉淀并转移至15mL离心管；

10）吸取25mL 80% Percoll至15mL离心管底部，稍微倾斜试管，将4mL的40% Percoll与细胞混合液慢慢沿管壁注入，形成密度梯度。注意：切勿破坏80%和40% Percoll及细胞悬浮液的界面，建议现配现用；

11）以800g、20°C离心20分钟，升速（ACC）1，降速（DEC）1；

12）离心结束后，吸取中间的白膜层免疫细胞至新的15mL离心管中，加入3倍体积的4°C预冷PBS，充分混匀后在4°C下以400g离心5分钟，弃去上清；

13）按步骤12重复清洗一次，最终得到肠道固有层的淋巴细胞；

14）使用细胞染色缓冲液（abs9475）重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×10⁶ cells/mL，将100μL的细胞悬液分配至12×75mm的流式管（abs7303），用于后续实验。

### 3. 相关产品推荐

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